UZ Gent laboratoriumgids     Code of Stukje omschrijving
 
 
Hoofdmenu Labgids
  Mutatieanalyse van genen betrokken bij CLL d.m.v. NGS (LG-411)
   Afdeling: Moleculaire Diagnostiek: HematologieAanvraagformulier:   Aanvraagformulier bijzondere hematologie - cytomorfologie | immunofenotypering | moleculaire analyses
StaaltypeBloed en beenmerg EDTA
Volume Beenmerg min. 1 mL, bloed 4 mL (min. 1 mL)
Uitvoering Wekelijks / Antwoordtijd = max. 25 dagen
Afnamecondities Vers afgenomen; aparte EDTA tube
Verzending Binnen 48h na afname
Methode Next Generation Sequencing (NGS); deels uitgevoerd door MDG (zie hieronder)
Opmerkingen
Chronische lymfocytaire leukemie (CLL) is een chronische lymfoproliferatieve aandoening van B-cellen. CLL wordt gekarakteriseerd door een progressieve accumulatie van functioneel incompetente lymfocyten, die monoklonaal zijn in origine. Het verloop van de ziekte is zeer variabel (van een indolent ziektebeeld tot agressieve pathologie), met een verwachte overleving van 2 tot 20 jaar na diagnose (mediaan 10 jaar). Een correcte staging bij diagnose is belangrijk om patiŽnten met een hoog risico op ziekteprogressie te identificeren en zo de meest geschikte behandeling te kunnen geven. Hiervoor werden verschillende schemaís ontwikkeld op basis van klinische parameters (Raji en Binet). FISH-analyses voor het opsporen van afwijkingen aan chromosomen 11, 12, 13 en 17, alsook de bepaling van de mutatiestatus van het variabele deel van de immunoglobuline zware keten receptoren (IGVH) genen geven belangrijke additionele prognostische informatie. 
Deze gekende prognostische factoren worden samengevat in onderstaande tabel (gunstig versus ongunstig):

GUNSTIGE PROGNOSE	                               ONGUNSTIGE PROGNOSE
vrouw	                                               man
geen prolymfocyten in bloed	                       aanwezigheid van prolymfocyten in bloed
lage Rai of Binet classificatie	                       hoge Rai of Binet classificatie
lymfocyten verdubbelingstijd >12 maand	               lymfocyten verdubbelingstijd <12 maand
lage serum waarden voor sCD23, β2-microglobuline, LDH  hoge serum waarden voor sCD23, β2-microglobuline, LDH
CD38 negatief	                                       CD38 positief
13q deletie	                                       11q deletie
trisomie 12	                                       17p deletie
gemuteerde IGVH	                                       ongemuteerde IGVH

De keuze van de genen waarvoor gescreend wordt naar mutaties/variaties werd bepaald op basis met gegevens van de literatuur, reeds bestaande commerciele CLL panels en de frequentie van voorkomen. Finaal detecteert deze methode somatische mutaties in BIRC3, NOTCH1, SF3B1 en TP53 (4 genen, 19 amplicons).

Voor het klinisch, prognostisch en therapeutisch belang van de individuele genen, wordt verwezen naar de informatie bij de respectievelijke genen. Dit is echter een continu evoluerend domein waarbij de opgegeven informatie zo goed als mogelijk accuraat zal worden bijgehouden.
 
Uitvoering:
De mutatieanalyse is gebaseerd op massive parallel sequencing, waarbij gebruik wordt gemaakt van een in-house protocol. In een eerste stap worden op het DNA verschillende multiplex en singleplex PCRs uitgevoerd. De amplicons worden vervolgens gelabled met patiŽnt-specifieke barcodes en de nodige adapters die sequencing op de MiSeq van Illumina toelaten. Na sequentie-bepaling worden de bekomen sequenties gealigneerd met de doelwitgenen en worden de variaties geIdentificeerd. Enkel varianten met een VAF (Variant Allele Frequency) van > 5% met klinische relevantie worden gerapporteerd. 
De library preparation, sequenering, primaire en secundaire data-analyse wordt uitgevoerd door het platform Moleculaire Diagnostiek UZ Gent (MDG) (https://www.cmgg.be/nl/zorgverlener/labguide/platform-moleculaire-diagnostiek-uz-gent-mdg) 

Belang pre-analytische fase - stabiliteit monsters: 
NGS gebeurt op DNA waardoor stalen (bloed of beenmerg EDTA) binnen 2 dagen na afname naar labo Klinische Biologie, lab moleculaire diagnostiek hematologie verzonden moeten worden.
 
Analytische gevoeligheid van assay: 
De analytische gevoeligheid (detectielimiet) is beperkt tot 1-5%, waardoor deze NGS techniek niet gevoelig genoeg is voor MRD bij follow-up. Het panel vertoont een specificiteit van 100 % (95% CI: 54.1 - 100.0%) en een sensitiviteit van 100 % (95% CI: 54.1 - 100.0%)

Terugbetaling:
Het opsporen van mutaties bij chronische lymfatische leukemie (CLL) valt onder de RIZIV verstrekking 588453-588464. Dit betekent dat verworven genafwijkingen in een diagnostische investigatiefase van een chronische lymfoÔde aandoening (waaronder CLL) 3x (per jaar) door middel van een moleculair biologische methode mogen worden aangerekend met een B-waarde van 3000 per test of gen. 
Accreditatie Ja (Accreditatie volgens BELAC-certificaat 087-MED)
Validatiedossier Ja
Gerelateerd BIRC3 (BIRC3),LG-412 (TP53 mutatieanalyse bij CLL),LG-413 (SF3B1 mutatieanalyse bij CLL),NOTCH1 (NOTCH1)
   Laatste manuele bijwerking: KRVDP op 23/10/2019

Labogids www.uzgent.be/labgids